mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为疾病的预防与治疗开辟了全新的视角。然而，mRNA技术的发展并非毫无挑战，其中最大的难题之一便是伴随生成的双链RNA（dsRNA）。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会引发机体的免疫反应，这对mRNA的安全性和有效性产生了影响。因此，如何减少dsRNA的形成，成为mRNA技术领域亟待解决的重要课题。

传统的解决方案依赖繁琐的纯化工艺，但这些方法成本高、效率低，且难以彻底清除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的关键酶，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性被认为是dsRNA形成的主要原因，因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，成为全球众多科研团队关注的焦点。

在2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal上发表了名为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们成功通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成，仅为野生型的18%，同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，推动了基因治疗和疫苗开发的进步。

我们创新性地结合了定向进化和半理性设计的方法，筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体。这些突变体在减少dsRNA的形成方面表现卓越。我们构建了随机突变库，并设计了一种实时监测液滴内RNA产物的完整性与dsRNA含量的分子探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终筛选出的关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T）产生的dsRNA含量显著低于野生型。

此外，我们还采用半理性设计方法，构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术识别有益的突变体。在筛选超过1000个突变体后，我们发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）产生的dsRNA含量显著低于野生型，并未影响转录效率。为了进一步优化，我们针对这些突变位点构建了DNA重组文库，并通过微孔板筛选获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E），其dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。

这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也展现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，发现最优突变体M11引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293 pg/mL。而在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定，显示出减少dsRNA对PKR介导的翻译抑制作用，提高了mRNA的治疗潜力。

为进一步解析突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验，揭示了突变体通过降低RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性来减少dsRNA的生成，这为未来优化T7RNAP提供了重要的理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的思路，也为mRNA技术的发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的形成，提升了mRNA的质量和安全性。凭借这一研究成果，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别的T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNAPolymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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