1. 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，用于检测组织、蜂蜜、鸡蛋等样本中的四环素类药物（Tetracyclines，TCs）。试剂盒的组成包括预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他相关试剂。在检测过程中，加入的标准品或样品溶液中的四环素类药物将与酶标板上预包被的偶联抗原竞争抗四环素类药物抗体。随后加入酶标记物并用TMB底物进行显色，样本的吸光度值与所含四环素类药物的含量呈负相关，通过与标准曲线对比即可得出样本中四环素类药物的残留量。

2. 技术指标

2.1 检测灵敏度

本试剂盒的灵敏度为0.05 ppb (ng/ml)。

2.2 反应模式

反应条件为37℃，分别反应30分钟和15分钟。

2.3 检测下限

不同样本的检测下限为：组织、肝脏、鸡蛋……2 ppb；蜂蜜……2 ppb；尿样……0.5 ppb；牛奶……2 ppb；奶粉……4 ppb。

2.4 交叉反应率

四环素……100%；强力霉素……70%；金霉素……10%；土霉素……10%

2.5 样本回收率

样本回收率为：组织……85±20%；肝脏、鸡蛋……75±20%；蜂蜜……85±20%；尿样……80±20%；牛奶、奶粉……75±20%。

3. 试剂盒组成

酶标板…96孔
高浓度标准品溶液1瓶：（1ml/瓶）100 ppb（注意密封）
标准品溶液：0 ppb、0.05 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.4 ppb、0.8 ppb（均为空瓶，现配现用）。
酶标记物（红盖）…11 ml
抗体工作液（蓝盖）…55 ml
底物液A（白盖）…6 ml
底物液B（黑盖）…6 ml
终止液（黄盖）…6 ml
20×浓缩洗涤液（白盖）…40 ml
5×复溶液（黄盖）…50 ml
说明书…1份
盖板膜…1张
自封袋…1个

4. 所需器材和试剂

4.1 仪器

准备酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管及天平（感量0.001g）。

4.2 微量移液器

单道20µl-200µl，100µl-1000µl，多道300µl。

4.3 试剂

浓盐酸、无水甲醇。

5. 样本前处理

5.1 样本处理前须知

实验器具必须洁净且使用一次性吸头，以避免污染和干扰实验结果。

5.2 配液

配液1：复溶液，将5×复溶液用去离子水5倍稀释（1份5×复溶液加4份去离子水），用于样本的复溶，复溶液在4℃可保存一个月。

配液2：工作洗涤液，将浓缩洗涤液20倍稀释（1份洗涤液加19份去离子水）。

配液3：样本提取液，取43mL浓盐酸加去离子水混匀，定容至50mL后加入450ml无水甲醇。

5.3 样本前处理步骤

5.3.1 组织、肝脏、鸡蛋样本处理方法

准确称取1±0.05g均质后样本于离心管中，加入2ml样本提取液（配液3），剧烈振荡2分钟，充分分散。
室温下4000转/分以上离心5分钟。
取50µl上层液体，加入950µl复溶液混匀，取50µl用于分析。

5.3.2 蜂蜜样本处理方法

准确称取1±0.05g蜂蜜于离心管中，加入1ml样本提取液（配液3），摇匀。
取50µl混合液，加入950µl复溶液混匀，取50µl用于分析。

5.3.3 尿样本处理方法

尿样用复溶液10倍稀释，若尿样浑浊需过滤或离心，清亮后取50µl用于分析。

5.3.4 牛奶样本处理方法

取1ml牛奶，加入2ml样本提取液（配液3），振荡2分钟，离心处理。
取50µl上层液，加入950µl复溶液，混匀，取50µl用于分析。

5.3.5 奶粉样本处理方法

称取1±0.05g奶粉，加入4ml样本提取液（配液3），振荡混匀，离心处理。
取50µl上层液，加入950µl复溶液，混匀，取50µl用于分析。

6. 酶联免疫试验步骤

取所需试剂回温30分钟以上，确保洗涤液无结晶，样本和标准品需编号并记录位置。加样反应时，加入标准品或样本50µl，然后加入抗体工作液，轻轻振荡混匀，37℃避光反应30分钟。

7. 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

计算公式为：百分吸光度值（%）＝A×100%/A0。

7.2 标准曲线的绘制与计算

将标准液百分吸光率与对应浓度（ppb）的对数绘制半对数曲线图。通过样本的百分吸光率在标准曲线上读出浓度，并乘以对应的稀释倍数即可。

8. 注意事项

室温低于25℃或试剂未回温会导致标准OD值偏低。
洗板过程中孔干燥可能影响重复性，尽快进行下一步操作。
确保混合均匀，洗板彻底，以提高分析的再现性。
在孵育过程中，使用盖板膜以避免光线照射。
不要使用过期试剂盒或混用不同批号的试剂。
若显色液变色则表明可能变质。

9. 贮藏及保存期

试剂盒宜在2-8℃保存，避免冷冻，有效期为1年，生产日期见包装盒。